En 1942 le fue concedida una beca para el estudio de una vacuna contra la gripe que le permitió colaborar con su antiguo profesor y prestigioso virólogo Thomas Francis, entonces en la Universidad de Michigan. En 1947, siendo director del laboratorio para la investigación vírica de la Universidad de Pittsburgh, la Fundación Nacional para la Parálisis Infantil le propuso unirse a los diferentes equipos que buscaban un remedio para la poliomielitis. En 1952 obtuvo un primer resultado en forma de vacuna trivalente, para la que empleó virus muertos por aplicación de formalina.
Tras probarla con animales y una pequeña población de niños que ya habían desarrollado la poliomielitis, los buenos resultados obtenidos animaron a la Fundación a financiar una extensa campaña de prueba que suscitó gran expectación pública. En 1955 anunció que su vacuna había sido probada con éxito y se convirtió de inmediato en un personaje célebre, hasta el punto de tener que dirigirse a la nación, a instancias del presidente Eisenhower, en un mensaje televisado.
Con el paso del tiempo, su vacuna acabó por ser sustituida en numerosos países por la más tradicional desarrollada por Albert Sabin, en la cual se empleaban virus vivos de actividad atenuada. En 1963 fundó el Instituto Salk en la localidad californiana de La Jolla, el cual poco después se convertiría en uno de los centros de investigación médica más importantes del mundo.
Cuatro años más tarde se divorció de su primera esposa y contrajo matrimonio con la ex esposa del pintor Pablo Picasso, Françoise Gilot. En 1975 renunció a la dirección del Instituto para proseguir su labor investigadora en el ámbito privado.
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